Première naissance d’un animal d’une sous espèce disparue (Capra pyrenaica pyrenaica) par clonage.
Le bouquetin des Pyrénées (C. p. pyrenaica) est une sous-espèce du bouquetin ibérique (Capra pyrenaica), décrite en 1910 par Cabrera. Dans la seconde moitié du 20ème siècle les effectifs de bouquetin des Pyrénées ont déclinés fortement. Puisqu’aucune méthode de préservation in situ n’a eu de succès, que les reproductions assistées en captivité et hybridations en milieux naturels n’ont pas non plus abouti, en 1999 il ne restait de cette sous-espèce qu’une femelle âgée de 12 ans. Dans un dernier effort de conservation, des tissus de peau ont été collectés, puis multipliés et congelés. Cette dernière représentante a disparu un an plus tard, entraînant avec elle l’extinction de sa sous-espèce.
Ici les auteurs présentent une expérience de clonage à partir des tissus préservés. Ils se basent sur des méthodes de transferts nucléaires et de transferts d’embryons, déjà utilisé dans des études précédentes. C'est le seul moyen d’éviter la disparition totale du bouquetin des Pyrénées.
Les auteurs procèdent à la reconstruction d’embryons à partir de cellules épithéliales (fibroblastes) de bouquetin des Pyrénées et d’oocytes énucléés de chèvres domestiques (Capra hircus). Une fois ces cellules fusionnées, les embryons reconstruits sont cultivés in vitro pendant 36h ou 7 jours (2 expériences différentes).
A la fin de cette période, les embryons jugés viables sont inséminés chez des femelles captives de bouquetins ibériques de la sous espèce hispanica (C. p. Hispanica, n=17) ou hybrides bouquetin ibériques x chèvre domestique (n=40). Des suivis de grossesses sont ensuite effectués sur chacune des mère porteuses.
A la suite de la mise à bas, des analyses moléculaire de l’ADN nucléaire et mitochondrial sont effectuées.
Enfin, des études pathologiques ont également été menées sur les organes vitaux (pesés, photographiés).
Toutes les procédures expérimentales suivent les directives européennes en vigueur lors de l’année de sortie de l’article (2009).
Sur l’ensemble des expériences d’inséminations, seuls les embryons des stades 3 à 6 cellules ont entraînés une grossesse chez les mères porteuses.
Parmi les deux expériences, seule une femelle “hybride” a menée sa grossesse à terme. Une femelle bouquetin des Pyrénées est née vivante, poids normal, sans aucune anomalie morphologique externe mais est décédée quelques minutes après d’une détresse respiratoire. L’autopsie a révélée que tous les organes de l’animal étaient normaux à l’exception de ses poumons. Un lobe supplémentaire, volumineux et non raccordé au système bronchique a été identifié.
Enfin, l’analyse de l’ADN nucléaire a confirmé que le nouveau-né était génétiquement identique au bouquetin des Pyrénées dont les cellules ont été clonées mais qu'il était bien différent génétiquement de la mère porteuse. L’analyse de l’ADN mitochondrial par contre, et comme attendu, à montré 100% de similitude entre le cabri et l’oocyte de la chèvre domestique.
Cet article est paru dans une revue à comité de relecture. Le contenu (protocole expérimental notamment) est cohérent avec l’objectif initial.
La rigueur scientifique est satisfaisante.
Cet article présente le premier cas de clonage d’une espèce disparue à l’aide d’une espèce proche. C’est à proprement parlé la première résurrection d’espèce éteinte par clonage interspécifique.
Apports importants au sujet de la technique de clonage, de l’utilisation d’espèces proches comme femelles porteuses ainsi que du développement d’embryons reconstitués par transferts nucléaire de tissus congelés.
Two experiments have been performed to clone the bucardo, an extinct wild goat. The karyoplasts were thawed fibroblasts derived from skin biopsies, obtained and cryopreserved in 1999 from the last living specimen, a female, which died in 2000. Cytoplasts were mature oocytes collected from the oviducts of superovulated domestic goats. Oocytes were enucleated and coupled to bucardo’s fibroblasts by electrofusion. Reconstructed embryos were cultured for 36 h or 7 d and transferred to either Spanish ibex or hybrid (Spanish ibex male x domestic goat) synchronized recipients. Embryos were placed, according to their developmental stage, into the oviduct or into the uterine horn ipsilateral to an ovulated ovary. Pregnancy was monitored through their plasmatic PAG levels. In Experiment 1, 285 embryos were reconstructed and 30 of them were transferred at the 3- to 6-cells stage to 5 recipients. The remaining embryos were further cultured to day 7, and 24 of them transferred at compact morula/blastocyst stage to 8 recipients. In Experiment 2, 154 reconstructed embryos were transferred to 44 recipients at the 3- to 6-cells stage. Pregnancies were attained in 0/8 and 7/49 of the uterine and oviduct-transferred recipients, respectively. One recipient maintained pregnancy to term, displaying very high PAG levels. One morphologically normal bucardo female was obtained by caesarean section. The newborn died some minutes after birth due to physical defects in lungs. Nuclear DNA confirmed that the clone was genetically identical to the bucardo’s donor cells. To our knowledge, this is the first animal born from an extinct subspecies.
